超速離心提取外泌體的過程
日期:2023-05-16 13:20:15
外泌體(extracellular vesicles,EVs)是30-1000納米的細胞外小囊泡,由多種類型的細胞分泌并在細胞間傳遞信息,具有重要的生理和病理功能。超速離心是目前提取外泌體的標準方法之一,下面將介紹超速離心提取外泌體的詳細過程。
1、樣品收集及預處理
首先,需要選擇合適的細胞培養基或體液,并進行一定的預處理。例如,將細胞培養液或血清在2000×g離心10分鐘去除細胞殘渣和碎屑。對于不同的樣本類型,需要采用不同的處理方法,確保樣品的干凈和高品質。
2、超速離心制備外泌體樣品
將處理后的樣品通過不同的離心步驟去除細胞碎屑、大顆粒物質和蛋白質,最終得到外泌體樣品。具體步驟如下:
1、300×g離心10分鐘:去除細胞碎屑和大顆粒物;
2、2000×g離心30分鐘:去除大量細胞碎屑和細胞器,得到粗外泌體(EVs P1)沉淀;
3、10000×g離心70分鐘:去除小型碎片和膜片,得到中外泌體(EVs P2)沉淀;
4、100000×g離心120分鐘以上:去除殘留蛋白和低密度顆粒物,得到純化外泌體(EVs P3)沉淀。
注意,在每次離心后將上清液收集備用。此外,所有步驟都需要在冰箱內進行,以防止樣品受熱或氧化,影響外泌體的完整性和質量。
3、洗滌和濃縮外泌體
為了去除離心過程中產生的雜質和其它污染物,需要對P3沉淀進行洗滌。常用的洗滌液包括PBS等緩沖鹽溶液。將P3沉淀加入PBS中,在低速離心下重新沉淀,取上清液繼續沉淀重復此步驟。這樣反復洗滌2-3次,最終得到較為純凈的外泌體樣品。
濃縮外泌體樣品是為了提高外泌體濃度和便于進一步分析。利用超濾膜或納濾管等裝置可以將外泌體樣品濃縮至需要的體積。同時,為了避免外泌體的損失和污染,要確保濃縮過程中的溫度和壓力等參數控制合適。
4、外泌體質量評估
確定超速離心提取外泌體后,需要對其進行質量評估和表征。常見的質量評估方法包括針對外泌體特異性標記蛋白(如CD63、CD9等)的WB和ELISA檢測,以及電子顯微鏡觀察外泌體形態和大小等。此外,也可以通過納米顆粒追蹤分析儀NanoSight等設備進行粒徑和分子數量的測定。
超速離心是目前提取外泌體的標準方法之一,主要依靠離心力去除細胞碎屑、蛋白質和小顆粒物,得到較干凈和高品質的外泌體樣品。但是,在實驗設計、樣品處理、離心條件和數據分析等方面均需要進行仔細和完善的規劃和調整,才能獲得準確和可靠的結果。
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