Q: 為什么在流式細(xì)胞術(shù)（FC）中觀察到兩個(gè)或更多的細(xì)胞群體？

可能存在的原因有：

a. 存在多個(gè)細(xì)胞群體表達(dá)目標(biāo)蛋白。您應(yīng)該檢查細(xì)胞分離是否充分。

b. 存在細(xì)胞二聚體。細(xì)胞二聚體將顯示為圖上大約兩倍熒光強(qiáng)度的第二個(gè)細(xì)胞群體。您應(yīng)該在染色之前和在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行之前使用移液管輕輕混合細(xì)胞。

Q：雙標(biāo)免疫熒光中抗體應(yīng)如何選擇？

在進(jìn)行雙標(biāo)記免疫熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇合適的抗體對(duì)于觀察兩個(gè)抗原蛋白在細(xì)胞中的共定位情況至關(guān)重要。以下是針對(duì)不同情況的抗體選擇方案：

a. 兩種直標(biāo)抗體：如果可用，應(yīng)選擇帶有不同熒光標(biāo)記物的兩個(gè)直接標(biāo)記的一抗。這樣可以減少二級(jí)抗體交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且操作更為簡(jiǎn)便。

b. 兩種間接標(biāo)記抗體：在這種情況下，需要選擇宿主來(lái)源（Host）不同的兩個(gè)一抗，分別搭配不同的熒光標(biāo)記物二抗，以避免交叉反應(yīng)。

c. 一個(gè)直標(biāo)抗體加一個(gè)間接標(biāo)記抗體：如果一個(gè)是直標(biāo)一抗的，而另一個(gè)是未標(biāo)記的，那么可以選擇宿主來(lái)源不同的一抗和相應(yīng)的二抗。這兩種抗體可以同時(shí)孵育，因?yàn)橹苯訕?biāo)記的一抗不會(huì)與另一個(gè)一抗的二抗發(fā)生交叉反應(yīng)。

d. 兩個(gè)間接標(biāo)記抗體，相同宿主來(lái)源：如果兩個(gè)一抗的宿主來(lái)源相同，那么需要先孵育一個(gè)一抗并使用相應(yīng)的二抗進(jìn)行檢測(cè)，然后再孵育第二個(gè)一抗，并使用其對(duì)應(yīng)的二抗。這樣可以避免相同宿主來(lái)源的二抗之間發(fā)生交叉反應(yīng)。