ELISA試劑盒常見問題及預(yù)防措施
酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
但在實(shí)際操作及分析中，總會出現(xiàn)各種問題，本次就ELISA常見問題分析匯總，希望對科研君的實(shí)驗(yàn)有所幫助。
問題1：高背景/非特異性顯色
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 建議或預(yù)防措施 |
|---|---|---|
| 終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或標(biāo)曲有線性但背景過高 | 整板發(fā)黃現(xiàn)象可能是錯(cuò)加其他試劑造成 | 實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組份及批號，確認(rèn)所有組份均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。 |
| 未充分清洗酶標(biāo)板 | 確保清洗過程中每個(gè)微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上輕拍幾下，以除去殘余的緩沖液。 | |
| 孵育時(shí)間過長 | 嚴(yán)格按照說明書操作。 | |
| 酶標(biāo)記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器，或陽性對照污染了微孔 | 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組份時(shí)，應(yīng)使用不同的儲液器皿。操作時(shí)請使用移液器。 | |
| 檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高 | 檢查濃度計(jì)算是否正確或進(jìn)一步稀釋后再使用。 | |
| 底物在使用前曝光或污染 | 加入底物前，應(yīng)始終避光保存。 | |
| 顯色時(shí)間過長 | 嚴(yán)格按照說明書顯色時(shí)間操作。 | |
| 讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 | TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以540nm或570nm作為校正波長。 |
問題2：白板
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 建議或預(yù)防措施 |
|---|---|---|
| 顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色；陽性對照不顯色 | 組份試劑混淆使用 | 配制或使用時(shí)應(yīng)看清楚標(biāo)簽。 |
| 洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈、無污染。 | |
| 遺漏了某種試劑或某個(gè)步驟 | 詳細(xì)審閱說明書，并嚴(yán)格遵循操作步驟。 |
問題3：顯色淡
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 建議或預(yù)防措施 |
|---|---|---|
| 包括標(biāo)曲、樣本在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡 | 試劑盒超過有效期或儲存不當(dāng) | 請?jiān)谟行趦?nèi)使用，并按照說明書推薦的保存條件保存，避免污染。 |
| 試劑、樣品用前未平衡 | 所有試劑、樣品應(yīng)置室溫平衡30min。 | |
| 移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔 | 校正移液器，吸頭要配套，每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快，排放應(yīng)完全。吸頭內(nèi)壁要清潔，最好一次性使用。 | |
| 孵育反應(yīng)時(shí)間不足 | 定時(shí)器準(zhǔn)確定時(shí)。 | |
| 顯色反應(yīng)時(shí)間不足 | 一般在15-30min，20min為佳，特殊除外。 | |
| 顯色劑加入順序顛倒（雙組份） | 請嚴(yán)格按說明書。 | |
| 洗滌次數(shù)增加，濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求 | 減少洗滌沖擊力，按說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記錄洗滌次數(shù)及用量。 | |
| 蒸餾水水質(zhì)有問題 | 確保配制試劑所需蒸餾水無污染。 | |
| 洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈、無污染。 | |
| 標(biāo)曲正常，樣本顯色較淡 | 樣本使用NaN3防腐，抑制了酶的反應(yīng) | 樣本樣本不可使用NaN3。 |
| 待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的 | 如有懷疑，可復(fù)檢。 | |
| 目測結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值偏低 | 讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 | TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以540nm或570nm作為校正波長。 |
問題4：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳/重復(fù)性不好
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 建議或預(yù)防措施 |
|---|---|---|
| 重復(fù)性差 | 標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤 | 嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行操作。僅使用推薦的稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。 |
| 試劑盒儲存方法不當(dāng)或儲存環(huán)境太差 | 請?jiān)谡f明書推薦的保存條件下保存，不要將重懸后的組份在室溫放置時(shí)間過長。 | |
| 過早稀釋各工作組分 | 各工作組份請?jiān)谑褂们?0分鐘配制，并立即加入到微孔中。 | |
| 樣本加入后未混勻 | 針對同時(shí)加入多種試劑組份，加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩(wěn)拿穩(wěn)放，防止外濺。 | |
| 酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差 | 校準(zhǔn)酶標(biāo)儀。 | |
| 孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 | 重復(fù)測定標(biāo)本，反應(yīng)條件、人員等盡可能與上次保持一致。 | |
| 洗滌不正確 | 移液器準(zhǔn)確吸取所需洗液體積并注入孔內(nèi)，切勿溢出。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分。 | |
| 孵育溫度恒溫效果不好 | 保證溫度恒定，避免局部溫度過高過低。 | |
| 加液時(shí)，過多殘留于孔壁上 | 加液時(shí)，吸頭在不碰到孔底或孔壁的前提下盡量懸空加。 | |
| 耗材重復(fù)使用 | 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組份時(shí)，應(yīng)使用不同的儲液器皿。 | |
| 微孔底部被劃傷或存在污垢 | 操作時(shí)細(xì)心，注意不要觸碰底部。擦拭酶標(biāo)板底部，以去除污垢或指紋。 | |
| 定性檢測結(jié)果判定時(shí)，閾值附近時(shí)陰時(shí)陽 | 同一樣品做3個(gè)復(fù)孔，以2個(gè)（含2個(gè)）以上相同結(jié)果為準(zhǔn)。 | |
| 加樣時(shí)交叉污染 | 加樣本時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。 | |
| 出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象 | 拍板時(shí)交叉污染 | 拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同一位置拍，以免交叉污染。 |
| 洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔 | 疏通洗板機(jī)加液頭。 | |
| 樣本離心處理不全，致使反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細(xì)胞成分干擾 | 存放的樣本應(yīng)充分離心。 | |
| 樣品放置時(shí)間過長，污染 | 樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染。 | |
| 洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 | 按說明書配制。 |
