畢赤酵母表達系統操作應用指南

日期：2023-05-25 14:39:48

一、實驗前準備

1、畢赤酵母菌株選用
根據目標表達蛋白的種類和性質，選擇適合的畢赤酵母菌株，例如X-33、GS115等菌株。

2、選擇表達載體
根據需要選擇不同的表達載體，常用的有pPICZ、pPIC9、pGAPZ等載體。

3、選擇啟動子和信號肽
根據表達蛋白的種類和性質，選擇適合的啟動子和信號肽。常用的啟動子有AOX1、GAP等，常用的信號肽有α-factor、Kex2等。

4、設計引物合成模板并克隆
根據目標序列設計引物并克隆到表達載體中，通常采用PCR擴增目標序列并構建重組載體。進行克隆前，應該檢查引物序列是否正確，并選擇適合的限制酶進行酶切。

5、菌種接種培養
取出冷凍保存的畢赤酵母菌株，接種在YPD固體培養基上，進行單克隆篩選和擴增。選用單克隆菌株接種到液體培養基中進行大量擴增，用于后續實驗。

6、培養基制備
準備適合的表達培養基，通常采用BMGY培養基進行前期培養，采用BMMY培養基進行表達。

7、質粒提取
在進行重組畢赤酵母工程表達前，需要將表達載體從大腸桿菌中提取并純化。

二、重組畢赤酵母工程的表達

1、初篩
將酵母菌株接種到BMGY液體培養基中，進行預培養。然后將菌株移植到BMMY液體培養基中，使其進入誘導表達階段。通過測定菌株OD值和表達蛋白的分子量，初步篩選出表達較好的菌株。

2、優化條件
根據初篩結果，調整表達條件，包括溫度、pH值、誘導時間、誘導劑濃度等參數進行優化，以獲得最佳的表達效果。

3、收獲表達產物
收獲表達過的畢赤酵母菌株，加入混合物中（如裂解緩沖液），使其發生破裂并釋放出表達產物。通過離心等方式，收集沉淀物或上清液，提取表達產物并進行純化。

4、驗證表達產物
對得到的表達產物進行質譜鑒定、SDS-PAGE凝膠電泳等檢驗手段進行驗證，檢測表達產物的分子量和純度，并對其進行功能分析。

三、實驗注意事項

在操作前應該全面了解畢赤酵母菌株的生長和表達特點，以及各種培養基和表達載體的優缺點。

1、在接種前，應該預先進行酵母菌株的檢測和鑒定，確保它們的純度和活性。

2、在誘導表達過程中，一定要嚴格控制條件和參數，避免對表達效果產生不良影響。

3、表達產物收獲后，應及時進行純化和驗證，以保證獲得高品質的表達產物。

4、操作過程中，應該注意實驗材料的無菌操作，使用優質的試劑和耗材，避免對實驗結果產生影響。

四、實驗總結

畢赤酵母表達系統是一種可靠和高效的重組蛋白表達方法。在實驗過程中，需要充分了解畢赤酵母的生長和表達特性，合理選擇表達載體和啟動子，并進行優化條件，以獲得高品質的表達產物。同時，在操作過程中，應該注意實驗材料的無菌操作，使用優質的試劑和耗材，避免對實驗結果產生影響。