酵母雙雜交自激活驗證的實驗步驟
日期：2023-08-21 16:47:33
酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid）是常用的蛋白質(zhì)相互作用的實驗技術(shù)。在進行雙雜交自激活驗證實驗時，可以按照以下步驟進行操作：
實驗前準備：
準備兩個酵母菌株：一個是用于檢測蛋白質(zhì)自激活的菌株（例如AH109），另一個是作為質(zhì)粒攜帶者和報告基因表達的菌株（例如Y187）。
構(gòu)建融合蛋白質(zhì)的載體：將待檢測蛋白的編碼序列克隆到適當?shù)碾p雜交載體中，通常包括激活區(qū)域（AD）和DNA結(jié)合區(qū)域（BD）。
驗證載體的無毒性：通過轉(zhuǎn)化含有空載體的菌株來驗證載體本身不會導致菌株生長異常。
轉(zhuǎn)化酵母菌株：
將質(zhì)粒攜帶者（例如Y187）和融合蛋白質(zhì)的載體（例如AH109）分別線性化，然后通過化學方法或電擊法將線性化DNA轉(zhuǎn)化到相應的酵母菌株中。
進行選擇培養(yǎng)：將轉(zhuǎn)化后的酵母菌分別移植到含有選擇性培養(yǎng)基的平板上，以篩選出具有正確載體的菌落。
進行交互檢測：
鑒定陽性相互作用：將篩選得到的陽性菌落分別提取DNA，進行PCR擴增和序列分析，確認融合蛋白質(zhì)的正確定序。
進行雙雜交驗證：將陽性菌株分別轉(zhuǎn)化到兩個不同的抗性選擇培養(yǎng)基中（例如TDO和QDO培養(yǎng)基），觀察是否出現(xiàn)報告基因（如 HIS3、Ade2和LacZ）表達的現(xiàn)象。
設(shè)置對照組：設(shè)置空載體對照和已知相互作用的陽性對照，以確保實驗結(jié)果的準確性。
結(jié)果分析：
觀察菌落生長情況：在選擇培養(yǎng)基上觀察菌落生長，陽性菌株應在TDO和QDO培養(yǎng)基上能夠生長。
檢測報告基因表達：使用相應的檢測方法（如X-gal染色、HIS3和Ade2的活性檢測）來測試報告基因的表達水平，以確認蛋白質(zhì)的相互作用。
以上步驟僅概述了雙雜交自激活驗證的基本流程，具體的實驗操作和條件可能因?qū)嶒災康暮驮噭┖械炔煌兴町悺Ｔ谶M行實驗前，請仔細閱讀相關(guān)文獻和試劑盒的說明，并按照其中提供的操作指南進行實驗。
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