細胞免疫治療-CAR-T細胞療法
日期：2019-09-10 10:49:50
癌癥治療方式一般包括三種，手術、化學療法和放射療法。但是近兩年，免疫療法在癌癥治療領域可謂占盡風頭，尤其免疫治療更是取得了前所未有的突破。免疫治療旨在增強患者免疫系統攻擊腫瘤的能力，目前已成為癌癥治療的“第五支柱”。前面已經詳細介紹過免疫治療藥物中的明星——PD-1/PD-L1抑制劑，目前為止，免疫治療藥物已在非小細胞肺癌、小細胞肺癌、三陰性乳腺癌和黑色素瘤等癌癥治療中占有一席之地。
然而，以PD-1/PD-L1為代表的免疫藥物僅僅是腫瘤免疫治療中的一方面，除了用藥物解除腫瘤細胞對免疫細胞的抑制，另一方面是直接利用患者體內的T細胞，將它們拿到體外進行改造，大量復制后再回輸到患者體內，這也就是常說的免疫細胞療法。
細胞免疫療法又稱為過繼細胞轉移（ACT），抽取和使用患者自身免疫細胞來治療他們的癌癥。目前細胞免疫療法包括腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、T細胞受體（TCR）和嵌合抗原受體（CAR）三中類型。其中CAR-T細胞療法是唯一在臨床開發方面取得重大進展的療法。針對這一細胞療法，我們分別從六個方面進行介紹，包括定義、過程、發展歷史、目標和挑戰等。
1. 什么是CAR-T細胞療法？
CAR-T細胞療法的全稱是chimeric antigen receptor T cell therapy，即嵌合抗原受體T細胞療法，原理是應用患者自身的T淋巴細胞，經過實驗室重新改造，裝載上具有識別腫瘤抗原的受體及共刺激分子，體外擴增后再次回輸入患者體內，從而識別并攻擊自身的腫瘤細胞。2014年，CAR-T細胞治療已在急性淋巴細胞白血病(ALL)中取得顯著療效，個性化治療效果顯著。這也給血液惡性腫瘤的治療帶來希望之光。
目前，已有兩種免疫細胞療法在2017年獲得美國FDA批準上市。即諾華的Kymriah，和Kite Pharmar的Yescarta，這兩款CAR-T療法的適應癥就是治療罹患B細胞前急性淋巴細胞白血病及復發或難治性大B細胞淋巴瘤的成人患者。不過遺憾的是，國內目前尚無批準上市的細胞療法。
2. 治療原理
CAR-T細胞療法一般要持續幾周時間，如圖1所示，簡單來說可分為5個步驟：
一是醫生利用白細胞分離技術從患者的血液中提取免疫T細胞；
二是利用基因工程技術給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞，并且同時激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體，T細胞立馬變身為高大上的CAR-T細胞。它不再是一個普通的T細胞，而是一個帶著GPS導航，隨時準備找到癌細胞，并發動自殺性襲擊，與之同歸于盡的“恐怖分子”T細胞；
三是體外培養，大量擴增CAR-T細胞，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細胞（體型越大，需要細胞越多）。
四是一旦有足夠的CAR-T細胞，擴增好的CAR-T細胞輸回病人體內。
五是嚴密監護病人，尤其是控制前幾天身體的劇烈反應。
Figure 1. The Processes of CAR-T Cell Therapy
3. CAR-T細胞療法的發展歷程
實際上，CAR-T技術已經使用多年，但近年才被改進為一種新型細胞療法應用于臨床。它對急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療療效顯著，被認為是最有希望的腫瘤治療方法。與所有技術一樣，CAR-T技術經歷了漫長的演變過程。也正是在這一系列演變中，CAR-T技術逐步走向成熟。這里，我們列出有代表性的三代CAR-T細胞療法。
3.1 第一代CAR-T細胞療法
第一代CAR介導的T細胞激活是通過CD3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3z鏈能夠提供激活T細胞、裂解靶細胞、調節IL-2分泌以及體內發揮抗腫瘤活性所需的信號。但第一代CAR改造T細胞的抗腫瘤活性在體內受到了限制，T細胞增殖減少最終會導致T細胞的凋亡。
3.2 第二代CAR-T細胞療法
第二代CAR介導的T細胞療法在細胞中添加了新的共刺激信號，可增強源自TCR / CD3復合物的原始“信號1”。 許多研究表明，增加了“信號2”的CAR-T 細胞療法與第一代相比，盡管第二代CAR在抗原特異性上沒有差異，但其T細胞增殖、細胞因子分泌、抗凋亡蛋白分泌的能力和細胞死亡延遲的時間都優于第一代CAR-T細胞療法。常用的共刺激分子是CD28，但隨后研究用CD137（4-1BB）代替了CD28。 此外，還提出了使用NK細胞受體CD244的想法。
3.3 第三代CAR-T細胞療法
為了進一步改良CAR的設計，許多研究組開始著眼于發展第三代CAR-T，不僅包括“信號1”、“信號2”，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同的靶點和共刺激信號開展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結果存在一定的差異性。一些研究報道表達第三代CAR的重組T細胞在抗腫瘤活性、存活周期及細胞因子釋放方面均顯著提高；Wilkie等的研究結果顯示靶向MUC1的第二代CAR與第三代CAR重組T細胞在抗腫瘤細胞毒性方面并無明顯差異，雖然表達第三代CAR的T細胞能夠分泌更大量的IFN-γ[1]。
4. CAR-T典型構造
典型的CAR由細胞外抗原結合區、跨膜區和細胞內信號轉導區組成。 如圖2所示，抗原結合區由輕鏈（v1）和衍生自單克隆抗體的重鏈（vh）組成，并通過鉸鏈區連接形成單鏈片段可變區（scfv）。 CAR結構的第一個關鍵部分是識別腫瘤抗原的單鏈抗體，例如CD19，EGFR等，而不是處理需要加工的抗原肽。
Figure 2. The Typical Structure of CAR-T
5. CAR-T細胞療法靶點
在過去幾年中，多個機構的臨床試驗對CAR修飾的T細胞（CAR-T細胞）治療B細胞惡性腫瘤進行了評估，如B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、慢性淋巴細胞白血病（CLL）和B細胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）可通過靶向CD19 [2] [3]、CD20 [4] 或CD30 [5]進行治療。除此之外，CAR-T細胞療法的靶位點還包括目前臨床中的CD22，CD123，CD133，PD-L1和HER2。
CD19，CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原。CD19分布于全體B細胞、毛細胞白血病細胞等惡性B細胞、濾泡樹狀細胞上，是診斷B細胞系腫瘤（白血病、淋巴瘤）和鑒定B細胞最好的標記。CD19特異性CAR-T細胞中B-ALL的成功率最高，其完全緩解率（CR）高達70~94％[6]。
CD20抗原是一種B細胞分化抗原，僅位于前B細胞和成熟B細胞，從pro-B期開始（CD45R+，CD117+）并且逐漸增加濃度直至成熟。它在95%以上的B細胞性淋巴瘤中表達，而在造血干細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達。一些研究表明，CD20是NHL免疫治療的理想靶抗原，因為它幾乎普遍表達在B細胞淋巴瘤表面的高拷貝數，并且調節最小[7] [8]。
CD30，也稱為TNFRSF8，是腫瘤壞死因子受體家族和腫瘤標志物的細胞膜蛋白。CD30廣泛表達于所有經典的霍奇金淋巴瘤（HL），間變性大細胞淋巴瘤（ALCL），部分其他淋巴細胞瘤，包擴皮膚T細胞淋巴瘤，彌漫性B細胞淋巴瘤細胞表面。在眾多候選靶點中脫穎而出，是目前淋巴瘤治療最有希望的靶點。臨床前研究已經證實了CD30CAR-T治療的可行性。
CD22特異表達于B細胞，隨著B細胞分化、成熟，CD22表達增加，但是它不表達于漿細胞。CD22與CD450R、CD75結合，介導B細胞與單核細胞、B細胞與T細胞和B細胞與B細胞之間的相互作用。它是屬于SIGLEC凝集素家族的分子和調節分子，可防止免疫系統的過度激活和自身免疫疾病的發展[9]。
CD123，也稱為IL-3受體，主要位于胞漿與胞膜，有助于傳遞白細胞介素-3的信號。白介素-3是免疫系統中重要的可溶性細胞因子。CD123在急性髓性白血病（AML）亞型中表達，包括白血病干細胞。
CD133，也稱為prominin-1，是一種5次跨膜糖蛋白，特異性定位于細胞突起。CD133抗原可被3種CD133抗體識別：克隆AC133、293C3和AC141。AC133直接與CD133/1糖基化抗原表位結合，可用于從外周血、骨髓、臍帶血及其它組織中分析和分選CD133+細胞。多數情況下CD133/1和CD133/2識別同種細胞，只是有表達強度的差別，但是在骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和某些急性髓性白血病中發現CD133/1和CD133/2表達不同，或者正常表達強度紊亂。
PD-L1首次被發現是由華裔學者陳列平教授在1999年作為B7家族的第3個成員B7-H1。次年，Tasuku Honjo與哈佛醫學院的Gordon Freeman證實B7-H1能夠與PD-1結合，抑制T細胞增殖以及細胞因子分泌，負調控淋巴細胞的激活。隨后，B7-H1也被更名為程序性死亡受體配體-1（PD-L1）。PD-L1除了會表達在腫瘤表面，參與免疫逃逸，還會在IFN-γ刺激下，表達在抗原提呈細胞（DC細胞、巨噬細胞等），以及血管內皮細胞的表面。
HER2，也稱為CD340，是人表皮生長因子受體（HER / EGFR / ERBB）家族的成員。大量數據表明該癌基因的擴增或過表達在某些侵襲性類型的乳腺癌的發展和進展中起重要作用。近年來，該蛋白已成為約30％乳腺癌患者的重要生物標志物和治療靶點[10]。
6. 其他T細胞療法
前面提到T細胞療法可分為三種類型，腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、T細胞受體（TCR）和嵌合抗原受體（CAR）。
6.1 腫瘤浸潤淋巴細胞
腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）是從腫瘤組織分離的淋巴細胞。它在體外由IL-2誘導，可以特異性殺死腫瘤細胞。這類細胞主要來源是通過手術切除獲得的實體腫瘤組織和浸潤淋巴結。由于TIL比LAK和CIK具有更強的腫瘤特異性，因此它是目前世界上研究和應用的主要免疫療法。
6.2 T細胞受體
T細胞受體（TCR）基因療法是指利用分子生物學方法克隆腫瘤特異性T細胞的TCR，并且通過含有TCR的病毒載體將TCR轉移到正常T細胞中，從而使這些T細胞成為腫瘤特異性殺傷細胞。在目前已有的臨床試驗中，TCR轉染的T細胞可以介導腫瘤消退，而且這些重新輸注的T細胞可以在體內存活超過半年。與前兩種T細胞療法相比，TCR基因治療的臨床療效相對較低，而尋找具有高親和力TCR受體的有效腫瘤靶抗原克隆并優化TCR轉化效率是當前的研究熱點。
References
[1] Wilkie S, Picco G, et al. Retargeting of human T cells to tumor associated MUC1: The evolution of a chimeric antigen receptor [J]. J Immunol. 2008, 180: 4901–4909.
[2] Maude SL, Frey N, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia [J]. N Engl J Med. 2014, 371(16):1507–17
[3] Kochenderfer JN, Dudley ME, et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor [J]. J Clin Oncol. 2015, 33(6):540–9.
[4] Zhang W-y, Wang Y, et al. Treatment of CD20-directed chimeric antigen receptor-modified T cells in patients with relapsed or refractory B cell non-Hodgkin lymphoma: an early phase IIa trial report [J]. Signal Transduction TargetTher. 2016, 1:16002.
[5] Wang CM, Wu ZQ, et al. Autologous T Cells expressing CD30 chimeric antigen receptors for relapsed or refractory Hodgkin lymphoma: an openlabel phase I trial [J]. Clin Cancer Res. 2016.
[6] Kochenderfer JN, Dudley ME, et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor [J]. J Clin Oncol. 2015, 33(6):540–9.
[7] Bindon CI, Hale G, et al. Importance of antigen specificity for complement-mediated lysis by monoclonal antibodies [J]. Eur J Immunol 1988; 18: 1507–1514.
[8] Brentjens RJ, Riviere I, et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias [J]. Blood. 2011; 118: 4817–4828.
[9] Hatta, et al. Identification of the gene variations in human CD22 [J]. Immunogenetics. 1999, 49 (4): 280–286.
[10] Mitri Z, Constantine T, et al. The HER2 Receptor in Breast Cancer: Pathophysiology, Clinical Use, and New Advances in Therapy [J]. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 743193.
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